La linfadenitis caseosa (LAC) es una enfermedad bacteriana supurativa cr\u00f3nica que afecta a ovinos. El agente etiol\u00f3gico es Corynebacterium pseudotuberculosis. El diagn\u00f3stico diferencial con otras afecciones que presentan manifestaciones cl\u00ednicas similares s\u00f3lo puede hacerse sobre la base del aislamiento y la identificaci\u00f3n del agente etiol\u00f3gico.<\/p>\n
El objetivo de este trabajo fue caracterizar metab\u00f3lica y gen\u00e9ticamente al agente causal de abscesos granulomatosos observados en ovinos en la regi\u00f3n patag\u00f3nica. En las muestras, se observ\u00f3 un contenido caseoso rodeado de una membrana fibrosa, y en el examen histopatol\u00f3gico, un centro de necrosis caseosa rodeado por c\u00e9lulas epitelioides, linfocitos y polinucleares. Mediante estudios microsc\u00f3picos, bacteriol\u00f3gicos y moleculares fue confirmada la infecci\u00f3n causada por C. pseudotuberculosis biovar ovis.<\/p>\n
Palabras clave: pseudotuberculosis, ovinos, Corynebacterium pseudotuberculosis.<\/p>\n
La linfadenitis caseosa (LAC), pseudotuberculosis, apostema de los ovinos o enfermedad de Preisz-Nocard, es una enfermedad bacteriana supurativa cr\u00f3nica que afecta principalmente a peque\u00f1os rumiantes. Puede causar enflaquecimiento y deterioro del estado general de los animales enfermos, que se traduce en la disminuci\u00f3n de la producci\u00f3n de lana, carne y leche.<\/p>\n
La enfermedad se presenta en las formas cut\u00e1nea y\/o visceral. La primera se caracteriza por la formaci\u00f3n de abscesos en el sistema linf\u00e1tico subcut\u00e1neo, que se palpan a trav\u00e9s de la piel. En la forma visceral, los abscesos se manifiestan en ganglios internos de la cavidad tor\u00e1cica y \u00f3rganos importantes, como pulmones, h\u00edgado y ri\u00f1ones (2, 7). El hallazgo de abscesos en ganglios linf\u00e1ticos y \u00f3rganos en ovinos de la regi\u00f3n patag\u00f3nica de Argentina es com\u00fan durante la faena.<\/p>\n
El agente causal de la LAC es Corynebacterium pseudotuberculosis. En estudios realizados por Songer et al., se identificaron dos biotipos basados en la producci\u00f3n de la enzima nitrato reductasa, y se han propuesto los t\u00e9rminos “biovar equi” para las especies que reducen nitratos y “biovar ovis” para aquellas que no cumplen con esa condici\u00f3n. La \u00faltima biovariedad es el agente etiol\u00f3gico de LAC en peque\u00f1os rumiantes.<\/p>\n
El objetivo de este trabajo fue caracterizar metab\u00f3lica y gen\u00e9ticamente al agente causal de abscesos granulomatosos observados en ovinos de la regi\u00f3n patag\u00f3nica argentina.
La poblaci\u00f3n en estudio fueron ovinos procedentes de la regi\u00f3n patag\u00f3nica austral de Argentina, de las razas Merino y Corriedale, de ambos sexos y de todas las categor\u00edas de ovinos adultos: borregos, ovejas, capones y carneros.<\/p>\n
Para el an\u00e1lisis se consideraron aquellos ovinos que mediante inspecci\u00f3n ocular y palpaci\u00f3n de canales y \u00f3rganos presentaron ganglios y v\u00edsceras de consistencia y tama\u00f1o anormal. Se observaron 600 animales sacrificados en un frigor\u00edfico local, de los cuales 180 (30%), cumplieron con los criterios de inclusi\u00f3n fijados.<\/p>\n
Una porci\u00f3n de cada esp\u00e9cimen fue fijada en formol al 10%, procesada por la t\u00e9cnica cl\u00e1sica de inclusi\u00f3n y cortes en bloques de parafina y coloreada con hematoxilina-eosina.
Una al\u00edcuota de aproximadamente 1 g del contenido interior de las lesiones se homogeneiz\u00f3 con 9 ml de soluci\u00f3n fisiol\u00f3gica est\u00e9ril mediante v\u00f3rtex.<\/p>\n
De esta suspensi\u00f3n se realiz\u00f3 microscop\u00eda y aislamiento. Las muestras se colorearon con las t\u00e9cnicas de Gram y de Ziehl Neelsen y se sembraron en agar sangre e incubaron en atm\u00f3sfera normal a 37 \u00b0C durante 48 a 72 h. La caracterizaci\u00f3n de las colonias se realiz\u00f3 de acuerdo al tama\u00f1o, pigmento, olor y presencia de hem\u00f3lisis.<\/p>\n
Las colonias aisladas se identificaron de manera preliminar, previa coloraci\u00f3n de Gram, con las pruebas de catalasa, oxidasa, oxidaci\u00f3n\/fermentaci\u00f3n de glucosa en agar cistina tripte\u00edna, producci\u00f3n de hem\u00f3lisis y efecto de los l\u00edpidos sobre el crecimiento. Adem\u00e1s, se realizaron las pruebas de hem\u00f3lisis sin\u00e9rgica frente a Rhodococcus equi (prueba de CAMP) y de inhibici\u00f3n de la β-hemolisina del Staphylococcus aureus (CAMP reversa), de sensibilidad frente al factor 0\/129 e hidr\u00f3lisis de gelatina a 22 \u00b0C. Estas pruebas se practicaron e interpretaron de acuerdo a metodolog\u00eda estandarizada.<\/p>\n
El sistema comercial API\u00ae Coryne (bioM\u00e9rieux, France) fue utilizado de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Los ensayos se incubaron 48 h a 37 \u00b0C.
La identificaci\u00f3n de las cepas se confirm\u00f3 por t\u00e9cnicas moleculares mediante la secuenciaci\u00f3n del gen 16S rDNA.<\/p>\n
La amplificaci\u00f3n de este gen se realiz\u00f3 con los primers correspondientes a la posici\u00f3n 827 y 1492 del gen 16S rDNA de Escherichia coli. Los productos de PCR fueron secuenciados utilizando el equipo Big Dye Terminator v3.1 Cycle sequencing kit (Applied Biosystems) y analizados en el ABI 377 Genetic Analyzer (PE Applied Biosystems). El alineamiento de las secuencias se realiz\u00f3 con el programa BLAST, compar\u00e1ndolas con secuencias disponibles en la base de datos del National Center for Biotecnology Information (NCBI).<\/p>\n
Para la identificaci\u00f3n bacteriana se utiliz\u00f3 el programa BIBI (Bioinformatics Bacterial Identification), cuya direcci\u00f3n electr\u00f3nica es, http:\/\/pbil.univ-lyon1.fr\/bibi\/, y mediante el programa CLUSTAL W se construy\u00f3 el \u00e1rbol y se establecieron las distancias filogen\u00e9ticas.
La sensibilidad a antibi\u00f3ticos se determin\u00f3 utilizando el m\u00e9todo de difusi\u00f3n con discos, de acuerdo a metodolog\u00edas est\u00e1ndar ya establecidas.<\/p>\n
Para ello se utiliz\u00f3 agar Mueller-Hinton suplementado con 5% de sangre ovina. Las lecturas de los halos de inhibici\u00f3n se realizaron a las 48 h y, dado que no hay valores de corte aceptados que espec\u00edficamente asignen categor\u00edas interpretativas para las corinebacterias, se utilizaron los valores recomendados por el National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) para Staphylococcus spp..<\/p>\n
Se analizaron 123 muestras de ganglios y v\u00edsceras, de consistencia y tama\u00f1o anormal, obtenidas de diferentes animales que cumplieron con el criterio de inclusi\u00f3n. Su distribuci\u00f3n fue la siguiente: ganglios superficiales (78), ganglios mediast\u00ednicos (18) y abscesos granulomatosos observados en pulmones (16), h\u00edgados (4) y ri\u00f1ones (7). Debido a problemas operativos, no fue posible determinar con certeza a qu\u00e9 n\u00famero de animales pertenec\u00edan los \u00f3rganos analizados.<\/p>\n
Macrosc\u00f3picamente, se observ\u00f3 en el interior de las muestras tejido necr\u00f3tico de consistencia caseosa en el 47% de los materiales, el 21% present\u00f3 n\u00facleos de calcificaci\u00f3n, el 19% con disposici\u00f3n en cat\u00e1fila de cebolla, y con contenido de pus verdoso y espeso en el 13%.<\/p>\n
Histol\u00f3gicamente, se determin\u00f3 un centro eosin\u00f3filo de necrosis de tipo caseosa rodeado por c\u00e9lulas epitelioides, linfocitos y polinucleares, m\u00e1s externamente tejido conectivo fibroso. Algunas muestras presentaron focos de calcificaci\u00f3n rodeados de envoltura fibrosa, con linfoplasmocitos y corona de linfocitos. Con la microscop\u00eda se pudieron reconocer formas bacilares gram-positivas agrupadas. No se observaron bacilos \u00e1cido-alcohol-resistente.<\/p>\n
En los cultivos predominaron colonias de 1 mm de di\u00e1metro, de color blanco y de consistencia seca, rodeadas de un halo tenue de β-hem\u00f3lisis. Se seleccionaron 89 cepas de bacilos gram-positivos peque\u00f1os, agrupados en empalizada, compatibles con corinebacterias.<\/p>\n
Los aislamientos fueron no lipof\u00edlicos, con metabolismo fermentativo; presentaron reacci\u00f3n positiva para las pruebas de catalasa, oxidasa, α-glucosidasa, ureasa, CAMP, CAMP reversa, producci\u00f3n de \u00e1cido a partir de glucosa y ribosa; y fueron negativos para reducci\u00f3n de nitrato, pirazinamidasa, pirrolidonil-arilamidasa, β-glucuronidasa, β-galactosidasa, N-acetil-β-glucosaminidasa, hidr\u00f3lisis de gelatina a 37 y 22 \u00b0C, fermentaci\u00f3n de: xilosa, manitol, lactosa y gluc\u00f3geno, y resistentes al factor 0\/129. El 50% de las cepas fueron fosfatasa alcalina positiva, el 70% ferment\u00f3 maltosa y el 40% sacarosa.
Con el m\u00e9todo molecular, se obtuvo una similitud del 99% con las secuencias de referencia de C. pseudotuberculosis CIP 102968T y NCTC 3450, depositadas en el GenBank.
Todas las cepas fueron sensibles a: penicilina (10U), vancomicina (30 \u00b5g), cefotaxima (30 \u00b5g), gentamicina (10 \u00b5g), kanamicina (120 \u00b5g), eritromicina (30 \u00b5g), tetraciclina (30 \u00b5g), ciprofloxacina (5 \u00b5g), norfloxacina (10 \u00b5g), ampicilina (10 \u00b5g), rifampicina (5 \u00b5g), trimetoprima-sulfametoxazol (25 \u00b5g), cloranfenicol (30 \u00b5g). El 16% mostr\u00f3 sensibilidad intermedia a amicacina (AMK-30 \u00b5g) y el 6% a nitrofuranto\u00edna (NIT-300 \u00b5g). La resistencia a oxacilina (1 \u00b5g) fue de 37%, a AMK 19% y a NIT 2%.<\/p>\n
Las caracter\u00edsticas macrosc\u00f3picas e histol\u00f3gicas de las muestras examinadas se correspondieron con las lesiones patognom\u00f3nicas de la enfermedad LAC (7).
Teniendo en cuenta los resultados de las observaciones microsc\u00f3picas y las pruebas preliminares, el microorganismo estudiado se consider\u00f3 perteneciente al g\u00e9nero Corynebacterium. El resultado negativo de la prueba de pirazinamidaza permiti\u00f3 agrupar las cepas dentro del grupo Corynebacterium diphteriae, del que forman parte las especies C. diphteriae, ulcerans y pseudotuberculosis.<\/p>\n
Las pruebas de ureasa y resistencia al factor O\/129 diferenciaron a C. pseudotuberculosis de las especies C. diphteriae y C. ulcerans, respectivamente. El an\u00e1lisis molecular permiti\u00f3 confirmar la identidad taxon\u00f3mica de la cepa como perteneciente a la especie C. pseudotuberculosis. Dado que las cepas no fueron productoras de nitratorreductasa, se clasificaron como biovariedad ovis.<\/p>\n
Las pruebas de CAMP y CAMP reversa confirmaron la producci\u00f3n de la toxina fosfolipasa D (FLD), determinante de patogenicidad de C. pseudotuberculosis. In vivo, la FLD hidroliza la esfingomielina de las membranas celulares endoteliales de vasos sangu\u00edneos y linf\u00e1ticos, facilitando la colonizaci\u00f3n y diseminaci\u00f3n del pat\u00f3geno en el hu\u00e9sped.<\/p>\n
Las caracter\u00edsticas bioqu\u00edmicas obtenidas coincidieron con las informadas en publicaciones de autores que estudiaron cepas de C. pseudotuberculosis en Francia, Rep\u00fablica Checa (8), Australia, Sud\u00e1frica, Estados Unidos y Canad\u00e1. El perfil de sensibilidad a los antibi\u00f3ticos fue similar al comunicado por Lipky et al. y Judson y Songer. Si bien las cepas resultaron sensibles a la mayor\u00eda de los antibi\u00f3ticos, ha sido demostrado que la eficacia de \u00e9stos in vivo resulta pr\u00e1cticamente nula.<\/p>\n
Mediante las metodolog\u00edas de laboratorio empleadas se confirm\u00f3 el diagn\u00f3stico de linfadenitis caseosa en las muestras analizadas. Este estudio permiti\u00f3, adem\u00e1s, caracterizar metab\u00f3licamente cepas aut\u00f3ctonas de C. pseudotuberculosis biovar ovis aisladas de ovinos de la regi\u00f3n patag\u00f3nica.<\/p>\n
S. Estevao Belchior1*, A. Gallardoz1, A. \u00c1balos1, Y. D\u00edaz1, L. \u00c1lvarez1, R. Callejo2, M.Prieto2, N. Jodor1, O. Jensen3<\/span>
1Centro Regional de Investigaci\u00f3n y Desarrollo Cient\u00edfico Tecnol\u00f3gico (CRIDECIT), Facultad de Ciencias Naturales, Universidad Nacional de la Patagonia San Juan Bosco, Ciudad Universitaria Km 4 (9000) Comodoro Rivadavia, Chubut; 2Servicio de Bacteriolog\u00eda Especial, INEI-ANLIS “Dr Carlos G. Malbr\u00e1n”, Avda. V\u00e9lez Sarsfield 563 (1281) Ciudad Aut\u00f3noma de Buenos Aires; 3Departamento de Zoonosis, Secretar\u00eda de Salud de la Provincia de Chubut, Chacra N\u00b0 18 (9020) Sarmiento, Chubut. Argentina.<\/div>\n<\/p>","protected":false},"excerpt":{"rendered":"
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La linfadenitis caseosa (LAC), pseudotuberculosis, apostema de los ovinos o enfermedad de Preisz-Nocard, es una enfermedad bacteriana supurativa cr\u00f3nica que afecta principalmente a peque\u00f1os rumiantes. Puede causar enflaquecimiento y deterioro del estado general de los animales enfermos, que se traduce en la disminuci\u00f3n de la producci\u00f3n de lana, carne y leche. La enfermedad se presenta en las formas cut\u00e1nea y\/o visceral. 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