Introducci\u00f3n<\/span>
El virus de la Diarrea Viral Bovina (vDVB) es un agente causante de grandes p\u00e9rdidas en el ganado bovino debido a los abortos, muertes perinatales, nacimientos prematuros y al amplio rango de malformaciones que produce. Este virus est\u00e1 clasificado por su estrategia replicativa como miembro de la familia Flaviviridae, g\u00e9nero Pestivirus, y se encuentra ampliamente difundido en la regi\u00f3n de la Cuenca Lechera Santafesina.<\/p>\nSe han descripto 2 genotipos de cepas del virus, de acuerdo con su comportamiento patog\u00e9nico y diferencias gen\u00f3micas: el 1, cl\u00e1sico, que causa los cuadros de diarrea y enfermedad de las mucosas, y el 2, que actuar\u00eda causando los s\u00edndromes hemorr\u00e1gicos y trombocitopatog\u00e9nicos. Las cepas del vDVB se clasifican en no citopatog\u00e9nicas (NCP) y citopatog\u00e9nicas (CP), de acuerdo al efecto que causan en cultivos celulares susceptibles(9).<\/p>\n
Dado que no existen signos cl\u00ednicos patognom\u00f3nicos de la infecci\u00f3n por DVB en bovinos, las investigaciones diagn\u00f3sticas dependen fundamentalmente de pruebas de laboratorio. Estas t\u00e9cnicas se basan en la detecci\u00f3n del virus, los ant\u00edgenos virales o los anticuerpos inducidos por el virus en las muestras obtenidas y en consecuencia, el vDVB puede ser diagnosticado por aislamiento, ELISA, PCR, Western blot e Inmunohistoqu\u00edmica (IHQ)(11).<\/p>\n
El desarrollo de nuevas t\u00e9cnicas inmunohistoqu\u00edmicas ha logrado una alta sensibilidad sin una reducci\u00f3n importante en su especificidad. Por otra parte, la generaci\u00f3n de anticuerpos mono y policlonales espec\u00edficos ha permitido la localizaci\u00f3n de ant\u00edgenos virales en preparaciones histol\u00f3gicas permanentes, preservando la morfolog\u00eda para una evaluaci\u00f3n m\u00e1s integral.<\/p>\n
La IHQ se ha transformado en los \u00faltimos a\u00f1os en una herramienta esencial en patolog\u00eda. Su principales ventajas son la facilidad de toma y remisi\u00f3n de muestras, la posibilidad de realizar estudios retrospectivos de muestras enviadas previamente para diagn\u00f3stico histopatol\u00f3gico y la asociaci\u00f3n precisa entre el ant\u00edgeno viral con tipos celulares y lesiones (7). Sin embargo su estandarizaci\u00f3n es laboriosa y la calidad de los resultados depende b\u00e1sicamente de la fijaci\u00f3n y procesamiento de los tejidos, desenmascaramiento de epitopes, sensibilidad de los sistemas de detecci\u00f3n y calidad de los anticuerpos (13).<\/p>\n
La aplicaci\u00f3n de la IHQ como t\u00e9cnica de rutina en el diagn\u00f3stico de DVB se enfrenta a la dificultad principal de la calidad del material o procesamiento de las muestras. La mayor\u00eda de los trabajos publicados hasta el presente, donde se ha inmunodetectado el vDVB, se han basado en la obtenci\u00f3n de las muestras y su procesamiento inmediato o en la utilizaci\u00f3n de cortes obtenidos por t\u00e9cnicas de congelaci\u00f3n sin fijaci\u00f3n form\u00f3lica (1,2,4,5,8,14). Sin embargo en las condiciones habituales de trabajo “a campo”, los materiales no son fijados adecuadamente ni procesados inmediatamente, lo que lleva a la sub o sobrefijaci\u00f3n con p\u00e9rdida de determinantes antig\u00e9nicos en mayor o menor medida.<\/p>\n
A fin de hacer frente a las dificultades ocasionadas por la sobrefijaci\u00f3n, se han desarrollado numerosos m\u00e9todos de recuperaci\u00f3n antig\u00e9nica, basados en procedimientos f\u00edsicos (microondas, ebullici\u00f3n, ultrasonido), qu\u00edmicos (digesti\u00f3n enzim\u00e1tica) o la combinaci\u00f3n de ambos, con la finalidad de poner en evidencia los ant\u00edgenos enmascarados por la fijaci\u00f3n (6, 12).<\/p>\n
El objetivo del presente trabajo fue estandarizar la t\u00e9cnica de inmunodetecci\u00f3n de vDVB en tejidos procesados seg\u00fan t\u00e9cnicas histol\u00f3gicas de rutina, a fin de facilitar su aplicaci\u00f3n como m\u00e9todo de diagn\u00f3stico. Para ello evaluamos varias combinaciones de m\u00e9todos de recuperaci\u00f3n antig\u00e9nica, concentraciones de anticuerpos y crom\u00f3genos a fin de lograr la mayor sensibilidad y especificidad, conservando de la mejor manera posible la morfolog\u00eda tisular.<\/p>\n
Materiales y m\u00e9todos<\/span>
Se obtuvieron muestras de diferentes \u00f3rganos de un ternero infectado persistentemente con aislamiento de vDVB tipo 1 a partir de sangre y pool de \u00f3rganos. Las muestras fueron fijadas en formol al 10% 24 h y procesadas siguiendo protocolos histol\u00f3gicos de rutina (15). Como control positivo se utilizaron muestras de piel de terneros persistentemente infectados facilitados por gentileza del Dr. Javier L\u00e9rtora (7). Como controles negativos se utilizaron materiales de diferentes \u00f3rganos de otras especies.<\/p>\nLos cortes se desparafinaron en xilol y se hidrataron en soluciones decrecientes de alcohol et\u00edlico y finalmente en buffer fosfato salino (PBS). Se realiz\u00f3 la inactivaci\u00f3n de la peroxidasa end\u00f3gena con H2O2 al 3% en metanol por 20 minutos (luego de la hidrataci\u00f3n) y el bloqueo de las uniones inespec\u00edficas con suero normal de cabra al 1% por 15 minutos (previo a la incubaci\u00f3n con el anticuerpo primario).<\/p>\n
La recuperaci\u00f3n antig\u00e9nica incluy\u00f3 4 tratamientos de digesti\u00f3n enzim\u00e1tica diferentes y sus combinaciones con tratamiento en microondas:
Digesti\u00f3n enzim\u00e1tica con las siguientes preparaciones comerciales ficina (Zymed\u00ae Digest-All Cat No. 00-3006) tripsina (Zymed\u00ae Digest-All Cat No. 00-3006) pepsina (Zymed\u00ae Digest-All Cat No. 00-3006) proteinasa K (Dako\u00ae Cat No. S3020).<\/p>\n
La incubaci\u00f3n con cada una de estas enzimas se realiz\u00f3 de acuerdo a las recomendaciones de los fabricantes, luego de la inactivaci\u00f3n de la peroxidasa.
El tratamiento con microondas se realiz\u00f3 en un equipo de uso dom\u00e9stico (potencia m\u00e1xima 1000 W). Como soluci\u00f3n se us\u00f3 buffer citrato 0,01 M pH 6,0, el cual se calent\u00f3 3 minutos a 100% de potencia, 12 minutos a 40% y 20 minutos dentro del microondas apagado (10).<\/p>\n
Como anticuerpos primarios se utilizaron los clones 157 (VMRD\u00ae Cat No. 157) dirigido espec\u00edficamente a la prote\u00edna E2 (gp53) del vDVB tipo 1 y BA-29 (VMRD\u00ae Cat No. BA\u00ad29) dirigido a la prote\u00edna E2 (gp53) del vDVB tipo 23. Ambos anticuerpos se probaron en diluciones entre 1:10 y 1:50 con tiempos de incubaci\u00f3n que variaron entre 1 h y 18 h, a 4\u00baC y temperatura ambiente.<\/p>\n
Para el revelado de la reacci\u00f3n ant\u00edgeno\u00adanticuerpo se utiliz\u00f3 el sistema biotina-streptoavidina-peroxidasa. El anticuerpo secundario biotinilado (Zymed\u00ae Cat No. 81\u00ad6540, diluci\u00f3n 1:120) se incub\u00f3 durante 30 minutos a temperatura ambiente al igual que el complejo streptoavidina-peroxidasa (Biogenex\u00ae Cat No. HK330-9K). Como crom\u00f3genos se utilizaron alternativamente aminoetilcarbazol (AEC) (Biogenex\u00ae Cat No. HK139-5K) o diaminobencidina (DAB) (Dako\u00ae Cat No. K3466). Entre cada uno de los pasos descriptos se efectuaron 3 lavados con PBS. Finalmente las muestras fueron coloreadas con hematoxilina y montadas con Ultramount (Dako\u00ae Cat No. S1964).<\/p>\n
Resultados<\/span>
Cuando no se efectu\u00f3 ning\u00fan tratamiento de recuperaci\u00f3n antig\u00e9nica, al igual que con el tratamiento con ficina o microondas solo, la inmunomarcaci\u00f3n fue negativa en todos los preparados en las diferentes diluciones y tiempos de incubaci\u00f3n empleados.
La digesti\u00f3n enzim\u00e1tica con tripsina y pepsina produjo una alta destrucci\u00f3n de los tejidos con reacci\u00f3n inespec\u00edfica tanto en los controles negativos como en el resto de las muestras.<\/p>\nEl tratamiento m\u00e1s efectivo fue el realizado con proteinasa K, utilizando diluciones de 1:30 para los anticuerpos primarios, con incubaci\u00f3n durante toda la noche a temperatura ambiente.<\/p>\n
Se obtuvieron buenos resultados con ambos crom\u00f3genos. Sin embargo, el AEC (rojo) permiti\u00f3 una mejor diferenciaci\u00f3n de la reacci\u00f3n frente a la presencia de pigmentos end\u00f3genos (melanina, bilirrubina, hemosiderina, etc).<\/p>\n
Los linfocitos del bazo, los ganglios linf\u00e1ticos y el timo tuvieron inmunomarcaci\u00f3n en la mayor\u00eda de los animales positivos. Tambi\u00e9n se observ\u00f3 inmunomarcaci\u00f3n en hepatocitos y c\u00e9lulas endoteliales de los vasos sangu\u00edneos, as\u00ed como en c\u00e9lulas epiteliales de los bronquios y alv\u00e9olos pulmonares (Figura 1).<\/p>\n
En intestino se observ\u00f3 reacci\u00f3n tanto en los enterocitos como en el tejido linf\u00e1tico asociado, sobre todo a nivel de la v\u00e1lvula ileocecal. En ri\u00f1\u00f3n se observaron inmunomarcadas algunas c\u00e9lulas epiteliales de los t\u00fabulos. En la piel se observ\u00f3 inmunomarcaci\u00f3n en las c\u00e9lulas epiteliales de los fol\u00edculos pilosos y las gl\u00e1ndulas sudor\u00edparas, as\u00ed como tambi\u00e9n en los endotelios de vasos sangu\u00edneos y linf\u00e1ticos. En dos de los casos positivos, en los cuales se remiti\u00f3 la placenta, se observ\u00f3 reacci\u00f3n positiva en las c\u00e9lulas epiteliales (Figura 2). Tambi\u00e9n se observ\u00f3 inmunomarcaci\u00f3n en las c\u00e9lulas epiteliales de los fol\u00edculos tiroideos. Se observaron cardiomiocitos inmunomarcados, aunque no en todos los casos positivos analizados.<\/p>\n
![](\"http:\/\/img27.imageshack.us\/img27\/4133\/67837505.jpg\")
Figura 1. Inmunomarcaci\u00f3n del virus de DVB en el pulm\u00f3n de un animal con cultivo positivo. Las flechas indican \u00e1reas de reacci\u00f3n positiva.<\/p>\n
![](\"http:\/\/img27.imageshack.us\/img27\/8740\/96969448.jpg\")
Figura 2. Inmunomarcaci\u00f3n del virus de DVB en placenta. La flecha indica \u00e1reas de reacci\u00f3n positiva.<\/p>\n
El tratamiento en horno de microondas no solo no mejor\u00f3 la reacci\u00f3n, si no que en el caso de la combinaci\u00f3n con proteinasa K, la reacci\u00f3n disminuy\u00f3 y se vio afectada la morfolog\u00eda del tejido con desprendimiento de las muestras.<\/p>\n
Discusi\u00f3n<\/span>
Uno de los aspectos cruciales de la IHQ es la retenci\u00f3n de los ant\u00edgenos en los tejidos, en una conformaci\u00f3n tal que puedan ser reconocidos por los anticuerpos. Como hemos mencionado, la reactividad de muchos ant\u00edgenos es alterada por la fijaci\u00f3n. Durante las \u00faltimas tres d\u00e9cadas, la IHQ se ha transformado en el m\u00e9todo auxiliar mas importante para la histopatolog\u00eda.
Sin embargo, la estandarizaci\u00f3n de estas t\u00e9cnicas contin\u00faa siendo un problema. La calidad de la inmunomarcaci\u00f3n depende principalmente de tres factores:
1) fijaci\u00f3n y procesamiento de los tejidos;
2) desenmascaramiento de los determinantes antig\u00e9nicos; y
3) sensibilidad de los sistemas de detecci\u00f3n (13).<\/p>\nEl formaldeh\u00eddo induce la formaci\u00f3n de uniones cruzadas entre prote\u00ednas, o entre prote\u00ednas y \u00e1cidos nucleicos, ocasionando el enmascaramiento de muchos determinantes antig\u00e9nicos (13). Por otra parte, el efecto de la deshidrataci\u00f3n y la temperatura de inclusi\u00f3n en parafina, tambi\u00e9n pueden afectar la conformaci\u00f3n o estabilidad de los ant\u00edgenos tisulares.<\/p>\n
Los determinantes antig\u00e9nicos que han sido ocultados o alterados por el formaldeh\u00eddo pueden ser desenmascarados, recuperando su conformaci\u00f3n. Como hemos mencionado, los m\u00e9todos m\u00e1s comunes utilizados para esto, son los tratamientos proteol\u00edticos o los basados en la utilizaci\u00f3n de m\u00e9todos f\u00edsicos como el calor o ultrasonido (6, 12).<\/p>\n
Nuestros resultados en relaci\u00f3n a las ventajas de la proteinasa K coinciden con trabajos previos de L\u00e9rtora et al.7, quienes trabajaron con muestras fijadas por corto tiempo en formol. Se ha publicado12 que para algunas prote\u00ednas, los tratamientos de alta temperatura (como el microondas en nuestro caso) pueden inducir una reacci\u00f3n negativa en la IHQ, lo que coincide con nuestros hallazgos.<\/p>\n
En trabajos previos, otros autores han realizado pruebas similares. Bel\u00e1k et al.2 realizaron la imunodetecci\u00f3n de ant\u00edgenos del vDVB sobre tejidos fijados en alcohol mediante tres anticuerpos monoclonales en alta concentraci\u00f3n (1:5). Allan et al.1 utilizaron tratamiento con proteasas, y pudieron obtener reacci\u00f3n en cortes por congelaci\u00f3n pero no resultados satisfactorios en materiales fijados en formol e incluidos en parafina. En este sentido, como ya hemos mencionado, la mayor\u00eda de los trabajos en este tema han sido realizados sobre materiales procesados por congelaci\u00f3n, lo que har\u00eda inviable esta t\u00e9cnica para el diagn\u00f3stico de rutina en condiciones de trabajo “a campo” (4,5,8,14).<\/p>\n
Conclusiones<\/span>
Como conclusi\u00f3n, podemos decir que la fijaci\u00f3n form\u00f3lica afecta la antigenicidad de la prote\u00edna E2 (gp53) del vDVB tipo 1 y 2. Sin embargo, estos efectos pueden ser revertidos por digesti\u00f3n proteol\u00edtica con proteinasa K previa a la incubaci\u00f3n con los anticuerpos primarios. Esto permitir\u00eda la utilizaci\u00f3n de la IHQ con estos anticuerpos como t\u00e9cnica de rutina para el diagn\u00f3stico de la DVB y tambi\u00e9n la realizaci\u00f3n de estudios retrospectivos sobre material de archivo.<\/p>\nAgradecimientos<\/span>
Este trabajo fue financiado por la Universidad Nacional del Litoral a trav\u00e9s del Programa CAID 2000, proyecto: Estudios comparativos entre aislamiento y t\u00e9cnicas inmunohistoqu\u00edmicas para el virus de la diarrea viral bovina con diferenciaci\u00f3n de tipos.<\/p>\nMarini, M.R.1; Canal, A.M.(1); Salvetti, N.R.(2); Ortega, H.H.(2, 3)
(1) C\u00e1tedra de Patolog\u00eda B\u00e1sica- Facultad de Ciencias Veterinarias. Universidad Nacional del Litoral.;
(2) Departamento de Anatom\u00eda e Histolog\u00eda Embriolog\u00eda. Facultad de Ciencias Veterinarias. Universidad Nacional del Litoral.;
(3) Consejo Nacional de Investigaciones Cient\u00edficas y Tecnol\u00f3gicas. Correspondencia: Dr. Hugo H. Ortega, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Nacional del Litoral. <\/div>\n
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ResumenEn el presente trabajo se evaluaron diferentes m\u00e9todos de recuperaci\u00f3n antig\u00e9nica para permitir la inmunodetecci\u00f3n del virus de la Diarrea Viral Bovina (vDVB) en materiales fijados con formol. Se analiz\u00f3 el efecto de la aplicaci\u00f3n de digesti\u00f3n proteol\u00edtica (ficina, tripsina, pepsina, proteinasa K) y su combinaci\u00f3n con tratamiento en un horno microondas empleando diferentes concentraciones y tiempos de incubaci\u00f3n para el anticuerpo primario. El tratamiento m\u00e1s efectivo fue el realizado con proteinasa K, utilizando diluciones de 1:30 para los anticuerpos primarios, con incubaci\u00f3n durante toda la noche a temperatura ambiente. Concluimos que la fijaci\u00f3n form\u00f3lica afecta la antigenicidad del vDVB pero estos efectos pueden ser revertidos por digesti\u00f3n proteol\u00edtica espec\u00edfica permitiendo la utilizaci\u00f3n de la inmunohistoqu\u00edmica como t\u00e9cnica de rutina para el diagn\u00f3stico de la enfermedad. Palabras clave: DVB; Recuperaci\u00f3n antig\u00e9nica; Inmunohistoqu\u00edmica. Introducci\u00f3nEl virus de la Diarrea Viral Bovina (vDVB) es un agente causante de grandes p\u00e9rdidas en el ganado bovino debido a los abortos, muertes perinatales, nacimientos prematuros y al amplio rango de malformaciones que produce. Este virus est\u00e1 clasificado por su estrategia replicativa como miembro de la familia Flaviviridae, g\u00e9nero Pestivirus, y se encuentra ampliamente difundido en la regi\u00f3n de la Cuenca Lechera Santafesina. Se han descripto 2 […]<\/p>\n","protected":false},"author":2,"featured_media":636,"comment_status":"closed","ping_status":"open","sticky":false,"template":"","format":"standard","meta":{"_acf_changed":false,"footnotes":""},"categories":[56],"tags":[],"class_list":["post-4077","post","type-post","status-publish","format-standard","has-post-thumbnail","hentry","category-infoganadero"],"acf":[],"yoast_head":"\n
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Se analiz\u00f3 el efecto de la aplicaci\u00f3n de digesti\u00f3n proteol\u00edtica (ficina, tripsina, pepsina, proteinasa K) y su combinaci\u00f3n con tratamiento en un horno microondas empleando diferentes concentraciones y tiempos de incubaci\u00f3n para el anticuerpo primario. El tratamiento m\u00e1s efectivo fue el realizado con proteinasa K, utilizando diluciones de 1:30 para los anticuerpos primarios, con incubaci\u00f3n durante toda la noche a temperatura ambiente. Concluimos que la fijaci\u00f3n form\u00f3lica afecta la antigenicidad del vDVB pero estos efectos pueden ser revertidos por digesti\u00f3n proteol\u00edtica espec\u00edfica permitiendo la utilizaci\u00f3n de la inmunohistoqu\u00edmica como t\u00e9cnica de rutina para el diagn\u00f3stico de la enfermedad. Palabras clave: DVB; Recuperaci\u00f3n antig\u00e9nica; Inmunohistoqu\u00edmica. 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formol. Se analiz\u00f3 el efecto de la aplicaci\u00f3n de digesti\u00f3n proteol\u00edtica (ficina, tripsina, pepsina, proteinasa K) y su combinaci\u00f3n con tratamiento en un horno microondas empleando diferentes concentraciones y tiempos de incubaci\u00f3n para el anticuerpo primario. El tratamiento m\u00e1s efectivo fue el realizado con proteinasa K, utilizando diluciones de 1:30 para los anticuerpos primarios, con incubaci\u00f3n durante toda la noche a temperatura ambiente. Concluimos que la fijaci\u00f3n form\u00f3lica afecta la antigenicidad del vDVB pero estos efectos pueden ser revertidos por digesti\u00f3n proteol\u00edtica espec\u00edfica permitiendo la utilizaci\u00f3n de la inmunohistoqu\u00edmica como t\u00e9cnica de rutina para el diagn\u00f3stico de la enfermedad. Palabras clave: DVB; Recuperaci\u00f3n antig\u00e9nica; Inmunohistoqu\u00edmica. Introducci\u00f3nEl virus de la Diarrea Viral Bovina (vDVB) es un agente causante de grandes p\u00e9rdidas en el ganado bovino debido a los abortos, muertes perinatales, nacimientos prematuros y al amplio rango de malformaciones que produce. Este virus est\u00e1 clasificado por su estrategia replicativa como miembro de la familia Flaviviridae, g\u00e9nero Pestivirus, y se encuentra ampliamente difundido en la regi\u00f3n de la Cuenca Lechera Santafesina. 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